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NEB無縫克隆
——同源重組Gibson組裝、Golden Gate 組裝


 
北京澤平代理的美國進(jìn)口NEB無縫克隆產(chǎn)品,提供基于同源重組Gibson組裝(吉布森組裝)的NEBuilder高保真無縫克隆試劑盒(含核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶),以及基于Golden Gate 組裝(金門組裝)的NEBridge無縫克隆試劑盒(BsaI-HFv2、BsmBI-v2)、50種IIS型限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等,支持≤52個片段的無縫組裝,具備高組裝效率、高靈活性,支持復(fù)雜DNA片段克隆,為生物實(shí)驗(yàn)分子克隆提供高性能的研究工具。

NEB無縫克隆,同源重組Gibson組裝、Golden Gate 組裝 代理商北京澤平


一、NEBuilder Gibson組裝

NEBuilder無縫克隆技術(shù),是對同源重組技術(shù)(即Gibson組裝、吉布森組裝)的升級,在待插入片段末端通過PCR擴(kuò)增添加15~30bp重疊序列,在等溫條件下,通過5'外切酶消化形成3'突出粘性末端,同源重組互補(bǔ)退火,高保真DNA聚合酶進(jìn)行延伸,高保真DNA連接酶補(bǔ)平缺口,可實(shí)現(xiàn)≤11個片段的高效無縫組裝,特別適合單鏈寡核苷酸ssOligo塔橋、文庫構(gòu)建、微型高通量克隆等應(yīng)用。

NEBuilder無縫克隆同源重組Gibson組裝吉布森組裝 代理商北京澤平
NEBuilder無縫克隆同源重組Gibson組裝吉布森組裝 代理商北京澤平

 
NEBuilder擁有>10年的開發(fā)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),性能指標(biāo)嚴(yán)格,保證數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn),具備高組裝效率、高保真度,即可解決復(fù)雜的高端克隆應(yīng)用,也可節(jié)省常規(guī)克隆后續(xù)篩選時間。

1、不依賴內(nèi)切酶——只需在多個片段末端添加重疊序列,僅質(zhì)粒載體線性化時需要酶切,不受限制性內(nèi)切酶所限,具備更大靈活性。

2、高組裝效率——支持≤11個片段的無縫組裝。

3、高保真度——使用高保真DNA聚合酶,即使5'末端、3'末端存在錯配,高保真DNA聚合酶可在退火后切割去除錯配序列(<10nt),組裝正確性高,無需反復(fù)篩選、測序。

4、兼容性強(qiáng)——支持<100bp片段、>10kb片段、低起始量組裝,可使用合成的單鏈寡核苷酸ssOligo連接2條雙鏈片段(如插入接頭、gRNA文庫)。

5、方便快速——只需15min、在同一管中即可完成無縫克隆。

6、設(shè)計(jì)工具——提供NEBuilder.neb.com 在線設(shè)計(jì)軟件,可以方便、快捷地進(jìn)行NEBuilder組裝引物設(shè)計(jì),以獲得高效率、高正確性的無縫組裝。

 

 
二、NEBridge Golden Gate 組裝

用于無縫克隆的Golden Gate 組裝技術(shù)(金門組裝技術(shù)),在dsDNA片段兩端通過PCR擴(kuò)增添加IIS型限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn),經(jīng)IIS內(nèi)切酶酶切后,識別位點(diǎn)被移除,形成互補(bǔ)的4堿基突出末端,再使用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接,可將多個DNA片段插入載體中, 實(shí)現(xiàn)兩個片段、或多個片段的克隆,且克隆后無額外堿基的插入。

NEBridge Golden Gate 組裝試劑,對傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行升級,成功實(shí)現(xiàn)≤52個片段的高效組裝,提供包括成品Golden Gate 試劑盒、50種IIS型限制性內(nèi)切酶、連接酶預(yù)混液(添加了連接增強(qiáng)劑)、經(jīng)典T4 DNA 連接酶等產(chǎn)品,幫助研究者快速構(gòu)建重組質(zhì)粒。

NEBridge Golden Gate組裝金門組裝 代理商北京澤平
以IIS型限制性內(nèi)切酶BsaI-HFv2為例,進(jìn)行Golden Gate 組裝時,需要在dsDNA片段的兩端加上其識別位點(diǎn)(GGTCTC)。酶切后,識別位點(diǎn)被移除,組裝片段末端帶有設(shè)計(jì)好的特定4堿基突出以指導(dǎo)組裝。



1、高組裝效率——支持≤52個片段的高效組裝,具備非常高的組裝效率和組裝準(zhǔn)確率,其中<30個片段的組裝效果更佳。

NEB 52個片段的Golden Gate 組裝 代理商北京澤平
對于包含12、24、35、52個片段的Golden Gate 組裝反應(yīng),顯示了含有正確組裝的菌落百分比。誤差線為至少3個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。以下幾篇文獻(xiàn)對此進(jìn)行了報(bào)道:


1. Pryor, J.M., et al. (2022) ACS Synth. Biol. e0525
2. Pryor, J. M. et al. (2020). PLoS One, e8592
3. Potapov, V. et al. (2018). ACS Synth. Biol., e0333 


 
2、豐富IIS型內(nèi)切酶——NEB提供業(yè)內(nèi)更多的50種IIS型限制性內(nèi)切酶,其中9種酶經(jīng)過Golden Gate 組裝驗(yàn)證,提供了更多酶切位點(diǎn)選擇。
 

IIS酶名稱 Golden Gate驗(yàn)證 熱滅活 反應(yīng)溫度 37°C時活性 識別位點(diǎn) 識別位點(diǎn)長度 突出端長度 同裂酶 甲基化敏感性 酶亞型
AcuI   37°C   CTGAAG(16/14) 6 2     IIC
AlwI   37°C   GGATC(4/5) 5 1   dam  
BaeI   25°C   (10/15)ACNNNNGTAYC(12/7) 7 5 & 5     IIC
BbsI  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   GAAGAC(2/6) 6 4     IIT
BbsI-HF  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   GAAGAC(2/6) 6 4     IIT
BbvI   37°C   GCAGC(8/12) 5 4      
BccI   37°C   CCATC(4/5) 5 1      
BceAI   37°C   ACGGC(12/14) 5 2   CpG  
BcgI   37°C   (10/12)CGANNNNNNTGC(12/10) 6 2 & 2   dam、CpG IIC
BciVI   37°C   GTATCC(6/5) 6 1      
BcoDI   37°C   GTCTC(1/5) 5 4 BsmAI CpG IIT
BfuAI   50°C 25% ACCTGC(4/8) 6 4 BspMI CpG  
BmrI   37°C   ACTGGG(5/4) 6 1      
BpmI   37°C   CTGGAG(16/14) 6 2     IIC
BpuEI   37°C   CTTGAG(16/14) 6 2     IIC
BsaI-HFv2  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   GGTCTC(1/5) 6 4   dcm、CpG IIT
BsaXI   37°C   (9/12)ACNNNNNCTCC(10/7) 6 3 & 3     IIC
BseRI   37°C   GAGGAG(10/8) 6 2     IIC
BsgI   37°C   GTGCAG(16/14) 6 2     IIC
BsmAI   55°C 50% GTCTC(1/5) 5 4 BcoDI CpG  
BsmBI-v2  經(jīng)驗(yàn)證 55°C 10% CGTCTC(1/5) 6 4 Esp3I CpG IIT
BsmFI   37°C   GGGAC(10/14) 5 4   CpG、dcm IIC
BsmI   65°C 10% GAATGC(1/-1) 6 2     IIT
BspCNI   37°C   CTCAG(9/7) 5 2     IIC
BspMI   37°C   ACCTGC(4/8) 6 4 BfuAI    
BspQI  經(jīng)驗(yàn)證 50°C 50% GCTCTTC(1/4) 7 3 SapI   IIT
BspQl-HF    37°C   GCTCTTC(1/4) 7 3 SapI   IIT
BsrDI   37°C   GCAATG(2/0) 6 2     IIT
BsrI   65°C 10% ACTGG(1/-1) 5 2     IIT
BtgZI  經(jīng)驗(yàn)證 60°C 50% GCGATG(10/14) 6 4   CpG IIC
BtsCI   50°C 25% GGATG(2/0) 5 2      
BtsI-v2   37°C   GCAGTG(2/0) 6 2     IIT
BtsIMutI   55°C 50% CAGTG(2/0) 5 2     IIT
CspCI   37°C   (11/13)CAANNNNNGTGG(12/10) 7 2 & 2     IIC
EarI   37°C   CTCTTC(1/4) 6 3   CpG IIT
EciI   37°C   GGCGGA(11/9) 6 2   CpG IIC
Esp3I  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   CGTCTC(1/5) 6 4 BsmBI-v2 CpG IIT
FauI   55°C 50% CCCGC(4/6) 5 2   CpG  
FokI   37°C   GGATG(9/13) 5 4   dcm、CpG  
HgaI   37°C   GACGC(5/10) 5 5   CpG  
HphI   37°C   GGTGA(8/7) 5 1   dam、dcm  
HpyAV   37°C   CCTTC(6/5) 5 1   CpG  
MboII   37°C   GAAGA(8/7) 5 1   dam  
MlyI   37°C   GAGTC(5/5) 5 0      
MmeI   37°C   TCCRAC(20/18) 6 2   CpG IIC
MnlI   37°C   CCTC(7/6) 4 1      
NmeAIII   37°C   GCCGAG(21/19) 6 2     IIC
PaqCI  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   CACCTGC(4/8) 7 4   CpG  
PleI   37°C   GAGTC(4/5) 5 1   CpG  
SapI  經(jīng)驗(yàn)證 37°C   GCTCTTC(1/4) 7 3 BspQI   IIT
SfaNI   37°C   GCATC(5/9) 5 4   CpG  


 
3、高兼容性——支持高GC含量、高重復(fù)序列、<100bp片段、>15kb片段的復(fù)雜組裝。

4、高保真度——NEB經(jīng)典T4連接酶,通過高保真末端連接,提高復(fù)雜多片段組裝的正確性(20個片段組裝正確率>90%);升級的NEBridge連接酶預(yù)混液,對緩沖液體系、操作步驟進(jìn)行優(yōu)化,搭配NEB IIS型內(nèi)切酶使用,可進(jìn)一步提高連接效率和保真度。

NEBridge連接酶預(yù)混液提高保真度 代理商北京澤平
圖. 使用NEBridge連接酶預(yù)混液進(jìn)行24個片段的Golden Gate 組裝。使用NEBridge連接酶預(yù)混液時,每微克載體DNA產(chǎn)生2.2±0.2*106個正確組裝的菌落,保真度為94.3±1%,而使用NEB T4 DNA 連接酶緩沖液時,每微克載體DNA產(chǎn)生8.3±2.1*105個正確組裝的菌落,保真度為69.8±10.7%。


5、使用靈活——提供Golden Gate 組裝試劑盒(BsaI-HFv2、BsmBI-v2)、50種IIS型限制性內(nèi)切酶、NEBridge連接酶預(yù)混液、T4 DNA 連接酶等豐富產(chǎn)品形式,供實(shí)驗(yàn)人員靈活使用。

6、操作簡單——酶切和連接反應(yīng)可在同一管中完成,簡化實(shí)驗(yàn)步驟。

7、設(shè)計(jì)工具——提供GoldenGate.neb.com 在線設(shè)計(jì)軟件,可以方便、快捷地進(jìn)行Golden Gate 組裝引物設(shè)計(jì),通過預(yù)測、評估粘性末端鏈接偏好,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜片段的高保真組裝。

 
 

DNA組裝選擇

 

NEB無縫克隆產(chǎn)品 NEBuilder高保真DNA組裝預(yù)混液E2621 Gibson組裝克隆試劑盒E5510 NEBridge Golden Gate 組裝試劑盒(BsaI-HF v2)E1601
NEBuilder高保真DNA組裝克隆試劑盒E5520 Gibson組裝預(yù)混液E2611 NEBridge Golden Gate 組裝試劑盒(BsmBI-v2)E1602
NEBuilder高保真DNA大片段組裝試劑盒E2623   NEBridge連接酶預(yù)混液 M1100
特性
去除5'或3'末端不匹配序列 ★★★ \ \
連接處高保真組裝 ★★★ ★★ ★★★
可用于末端重復(fù)序列 \ \ ★★★
產(chǎn)物完全連接 ★★★ ★★★ ★★★
雙鏈DNA和單鏈寡核苷酸連接 ★★★ ★★ \
高效組裝微量DNA ★★★ ★★ ★★
重疊區(qū)序列長度可變 ★★★ ★★★ \
應(yīng)用
2個片段組裝(簡單克。 ★★★ ★★★ ★★★
3~6個片段組裝(單管完成) ★★★ ★★★ ★★★
7~11個片段組裝(單管完成) ★★★ ★★ ★★★
12~50個片段組裝(單管完成) \ \ ★★★
用于體外轉(zhuǎn)錄的模板制備 ★★★ ★★★ ★★★
合成組裝全基因組 ★★★ \ \
多位點(diǎn)突變 ★★★ ★★ ★★
文庫構(gòu)建 ★★★ ★★★ ★★★
改裝代謝途徑 ★★★ ★★ ★★★
TALENs基因編輯 ★★ ★★ ★★★
短發(fā)夾RNA(shRNA)克隆 ★★★ ★★ \
gRNA文庫構(gòu)建 ★★★ ★★ \
大片段組裝(>10kb) ★★★ ★★★ ★★★
小片段組裝(<100bp) ★★★ \ ★★★
連續(xù)多輪內(nèi)切酶組裝 ★★★ \ \


 

 
北京澤平代理的NEB無縫克隆產(chǎn)品

 

貨號 英文名稱 中文名稱 包裝規(guī)格
E2621S NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix - 10 reactions NEBuilder高保真DNA組裝預(yù)混液 10 rxns
E2621L NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix - 50 reactions NEBuilder高保真DNA組裝預(yù)混液 50 rxns
E2621X NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix - 250 reactions NEBuilder高保真DNA組裝預(yù)混液 250 rxns
E2611L Gibson Assembly Master Mix - 50 reactions Gibson Assembly 組裝預(yù)混液 50 rxns
E2611S Gibson Assembly Master Mix - 10 reactions Gibson Assembly 組裝預(yù)混液 10 rxns
E1601L NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF-v2) - 100 reactions NEB Golden Gate 組裝試劑盒(BsaI-HF v2) 100 rxns
E1601S NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF-v2) - 20 reactions NEB Golden Gate 組裝試劑盒(BsaI-HF v2) 20 rxns
E1602L NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) - 100 reactions NEB Golden Gate 組裝試劑盒(BsmBI-v2) 100 rxns
E1602S NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) - 20 reactions NEB Golden Gate 組裝試劑盒(BsmBI-v2) 20 rxns
M1100L NEBridge Ligase Master Mix - 250 reactions NEBridge連接酶預(yù)混液 250 reactions
M1100S NEBridge Ligase Master Mix - 50 reactions NEBridge連接酶預(yù)混液 50 rxns
R0641L AcuI - 1500 units AcuI內(nèi)切酶 1500 units
R0641S AcuI - 300 units AcuI內(nèi)切酶 300 units
R0513L AlwI - 2500 units AlwI內(nèi)切酶 2500 units
R0513S AlwI - 500 units AlwI內(nèi)切酶 500 units
R0613S BaeI - 250 units BaeI內(nèi)切酶 250 units
R0539L BbsI - 1500 units BbsI內(nèi)切酶 1500 units
R0539S BbsI - 300 units BbsI內(nèi)切酶 300 units
R0539V BbsI - 150 units BbsI內(nèi)切酶 150 units
R3539L BbsI-HF - 1500 units BbsI-HF內(nèi)切酶 1500 units
R3539S BbsI-HF - 300 units BbsI-HF內(nèi)切酶 300 units
R3539M BbsI HF - 1000 units(High Concentration) BbsI-HF內(nèi)切酶(高濃度) 1000 units
R0173S BbvI - 300 units BbvI內(nèi)切酶 300 units
R0173V BbvI - 150 units BbvI內(nèi)切酶 150 units
R0704L BccI - 5000 units BccI內(nèi)切酶 5000 units
R0704S BccI - 1000 units BccI內(nèi)切酶 1000 units
R0623L BceAI - 250 units BceAI內(nèi)切酶 250 units
R0623S BceAI - 50 units BceAI內(nèi)切酶 50 units
R0545S BcgI - 250 units BcgI內(nèi)切酶 250 units
R0596L BciVI - 1000 units BciVI內(nèi)切酶 1000 units
R0596S BciVI - 200 units BciVI內(nèi)切酶 200 units
R0542S BcoDI - 1000 units BcoDI內(nèi)切酶 1000 units
R0542V BcoDI - 500 units BcoDI內(nèi)切酶 500 units
R0701L BfuAI - 1250 units BfuAI內(nèi)切酶 1250 units
R0701S BfuAI - 250 units BfuAI內(nèi)切酶 250 units
R0600S BmrI - 100 units BmrI內(nèi)切酶 100 units
R0565L BpmI - 500 units BpmI內(nèi)切酶 500 units
R0565S BpmI - 100 units BpmI內(nèi)切酶 100 units
R0633S BpuEI - 500 units BpuEI內(nèi)切酶 500 units
R3733L BsaI-HFv2 - 5000 units BsaI-HFv2內(nèi)切酶 5000 units
R3733S BsaI-HFv2 - 1000 units BsaI-HFv2內(nèi)切酶 1000 units
R3733V BsaI-HFv2 - 500 units BsaI-HFv2內(nèi)切酶 500 units
R0609L BsaXI - 500 units BsaXI內(nèi)切酶 500 units
R0609S BsaXI - 100 units BsaXI內(nèi)切酶 100 units
R0581L BseRI - 1000 units BseRI內(nèi)切酶 1000 units
R0581S BseRI - 200 units BseRI內(nèi)切酶 200 units
R0581V BseRI - 100 units BseRI內(nèi)切酶 100 units
R0559L BsgI - 250 units BsgI內(nèi)切酶 250 units
R0559S BsgI - 50 units BsgI內(nèi)切酶 50 units
R0529L BsmAI - 5000 units BsmAI內(nèi)切酶 5000 units
R0529S BsmAI - 1000 units BsmAI內(nèi)切酶 1000 units
R0529V BsmAI - 500 units BsmAI內(nèi)切酶 500 units
R0739L BsmBI-v2 - 1000 units BsmBI-v2內(nèi)切酶 1000 units
R0739S BsmBI-v2 - 200 units BsmBI-v2內(nèi)切酶 200 units
R0572L BsmFI - 500 units BsmFI內(nèi)切酶 500 units
R0572S BsmFI - 100 units BsmFI內(nèi)切酶 100 units
R0572V BsmFI - 50 units BsmFI內(nèi)切酶 50 units
R0134L BsmI - 2500 units BsmI內(nèi)切酶 2500 units
R0134S BsmI - 500 units BsmI內(nèi)切酶 500 units
R0134V BsmI - 250 units BsmI內(nèi)切酶 250 units
R0624S BspCNI - 100 units BspCNI內(nèi)切酶 100 units
R0502S BspMI - 100 units BspMI內(nèi)切酶 100 units
R0712L BspQI - 2500 units BspQI內(nèi)切酶 2500 units
R0712S BspQI - 500 units BspQI內(nèi)切酶 500 units
R0574L BsrDI - 1000 units BsrDI內(nèi)切酶 1000 units
R0574S BsrDI - 200 units BsrDI內(nèi)切酶 200 units
R0527L BsrI - 5000 units BsrI內(nèi)切酶 5000 units
R0527S BsrI - 1000 units BsrI內(nèi)切酶 1000 units
R0527V BsrI - 500 units BsrI內(nèi)切酶 500 units
R0703L BtgZI - 500 units BtgZI內(nèi)切酶 500 units
R0703S BtgZI - 100 units BtgZI內(nèi)切酶 100 units
R0647S BtsCI - 2000 units BtsCI內(nèi)切酶 2000 units
R0664S BtsIMutI - 100 units BtsIMutI內(nèi)切酶 100 units
R0667L BtsI-v2 - 2500 units BtsI-v2內(nèi)切酶 2500 units
R0667S BtsI-v2 - 500 units BtsI-v2內(nèi)切酶 500 units
R0645S CspCI - 500 units CspCI內(nèi)切酶 500 units
R0528L EarI - 2500 units EarI內(nèi)切酶 2500 units
R0528S EarI - 500 units EarI內(nèi)切酶 500 units
R0528V EarI - 250 units EarI內(nèi)切酶 250 units
R0590L EciI - 500 units EciI內(nèi)切酶 500 units
R0590S EciI - 100 units EciI內(nèi)切酶 100 units
R0734L Esp3I - 1500 units Esp3I內(nèi)切酶 1500 units
R0734S Esp3I - 300 units Esp3I內(nèi)切酶 300 units
R0651S FauI - 200 units FauI內(nèi)切酶 200 units
R0109L FokI - 5000 units FokI內(nèi)切酶 5000 units
R0109S FokI - 1000 units FokI內(nèi)切酶 1000 units
R0109V FokI - 500 units FokI內(nèi)切酶 500 units
R0154S HgaI - 100 units HgaI內(nèi)切酶 100 units
R0154V HgaI - 50 units HgaI內(nèi)切酶 50 units
R0158L HphI - 5000 units HphI內(nèi)切酶 5000 units
R0158S HphI - 1000 units HphI內(nèi)切酶 1000 units
R0158V HphI - 500 units HphI內(nèi)切酶 500 units
R0621L HpyAV - 500 units HpyAV內(nèi)切酶 500 units
R0621S HpyAV - 100 units HpyAV內(nèi)切酶 100 units
R0148L MboII - 1500 units MboII內(nèi)切酶 1500 units
R0148S MboII - 300 units MboII內(nèi)切酶 300 units
R0148V MboII - 150 units MboII內(nèi)切酶 150 units
R0610L MlyI - 5000 units MlyI內(nèi)切酶 5000 units
R0610S MlyI - 1000 units MlyI內(nèi)切酶 1000 units
R0637L MmeI - 500 units MmeI內(nèi)切酶 500 units
R0637S MmeI - 100 units MmeI內(nèi)切酶 100 units
R0163L MnlI - 2500 units MnlI內(nèi)切酶 2500 units
R0163S MnlI - 500 units MnlI內(nèi)切酶 500 units
R0163V MnlI - 250 units MnlI內(nèi)切酶 250 units
R0711S NmeAIII - 250 units NmeAIII內(nèi)切酶 250 units
R0745L PaqCI - 1000 units PaqCI內(nèi)切酶 1000 units
R0745S PaqCI - 200 units PaqCI內(nèi)切酶 200 units
R0515S PleI - 1000 units PleI內(nèi)切酶 1000 units
R0569L SapI - 1250 units SapI內(nèi)切酶 1250 units
R0569S SapI - 250 units SapI內(nèi)切酶 250 units
R0172S SfaNI - 300 units SfaNI內(nèi)切酶 300 units
R0172V SfaNI - 150 units SfaNI內(nèi)切酶 150 units
M0202L T4 DNA Ligase - 100000 units T4 DNA 連接酶 100,000 units
M0202S T4 DNA Ligase - 20000 units T4 DNA 連接酶 20,000 units
M0202V T4 DNA Ligase - 10,000 units T4 DNA 連接酶 10,000 units
M0202M T4 DNA Ligase - 100000 units(High Concentration) T4 DNA 連接酶(高濃度) 100,000 units
M0202T T4 DNA Ligase - 20000 units(High Concentration) T4 DNA 連接酶(高濃度) 20,000 units

 


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