IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)
IDT（Integrated DNA Technologies）作為核酸定制合成領(lǐng)域的知名企業(yè)，依托30年來的技術(shù)研發(fā)，推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產(chǎn)品，通過對(duì)gRNA序列、Cas9核酸酶優(yōu)化，對(duì)RNP轉(zhuǎn)染效率、同源重組修復(fù)HDR效率的提升，形成了從crRNA設(shè)計(jì)到CRISPR結(jié)果檢測的一站式解決方案，讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)更高效、更簡單。
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)，分別對(duì)crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進(jìn)行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾，對(duì)化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）轉(zhuǎn)染RNP，可進(jìn)行精確地基因編輯操作。
傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas9質(zhì)粒的方法，質(zhì)粒大小高達(dá)6-10kb，很難轉(zhuǎn)染，而如使用原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法，通過優(yōu)化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上，提高轉(zhuǎn)染效率、減少細(xì)胞毒性、降低脫靶，進(jìn)而提高了基因編輯效率。
Alt-R® CRISPR-Cas9實(shí)驗(yàn)流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)Alt-R® crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補(bǔ)，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合，通過crRNA的重復(fù)序列區(qū)（Repeats）與tracrRNA堿基配對(duì), 形成向?qū)NA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核；
5、通過crRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識(shí)別PAM序列（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對(duì)DNA進(jìn)行剪切；
6、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實(shí)現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)供體DNA模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)（Homology directed repair，簡稱HDR），實(shí)現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方法二】
1、（用IDT工具）設(shè)計(jì)sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補(bǔ)，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識(shí)別PAM序列，對(duì)DNA進(jìn)行剪切；
5、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因敲除；
②（用IDT工具）設(shè)計(jì)供體DNA模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。
Alt-R® crRNA序列設(shè)計(jì)示意圖
Alt-R® CRISPR-Cas9產(chǎn)品
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細(xì)胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
包裝 |
| crRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA |
2 nmol |
管 |
| 10 nmol |
管 |
| 2 nmol |
板 |
| 10 nmol |
板 |
| 50 nmol |
管 |
| 100 nmol |
管 |
2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，經(jīng)其他化學(xué)修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn)，可提高基因編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
包裝 |
| crRNA XT |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT |
2 nmol |
管 |
| 10 nmol |
管 |
| 2 nmol |
板 |
| 10 nmol |
板 |
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個(gè)RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經(jīng)化學(xué)修飾，穩(wěn)定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn)。相比體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA，減少細(xì)胞免疫反應(yīng)，更小細(xì)胞毒性。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
| sgRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA |
2 nmol |
| 10 nmol |
| 50 nmol |
| 100 nmol |
| Custom Alt-R® CRISPR sgRNA |
定制 |
4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經(jīng)化學(xué)修飾，具有核酸酶抗性�？商峁晒鈽�(biāo)記，檢測轉(zhuǎn)染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
特點(diǎn) |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| tracrRNA |
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA |
無標(biāo)記 |
5 nmol |
1072532 |
| 20 nmol |
1072533 |
| 100 nmol |
1072534 |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO 550 |
熒光標(biāo)記 |
5 nmol |
1075927 |
| 20 nmol |
1075928 |
圖.穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Alt-R® crRNA(未標(biāo)記):tracrRNA(標(biāo)記)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，熒光顯微鏡下10倍放大。
5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標(biāo)簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，經(jīng)序列優(yōu)化，提高中靶率，降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| cas9核酸酶 |
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3 |
100 µg |
1081058 |
| 500 µg |
1081059 |
| Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 |
100 µg |
1081060 |
| 500 µg |
1081061 |
6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域功能失活，對(duì)DNA靶向鏈進(jìn)行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH結(jié)構(gòu)域失活，對(duì)非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| cas9切口酶 |
Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3 |
100 µg |
1081062 |
| 500 ug |
1081063 |
| Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3 |
100 µg |
1081064 |
| 500 ug |
1081065 |
7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，喪失內(nèi)切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進(jìn)行基因下調(diào)（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近才能發(fā)揮功能，其脫靶率遠(yuǎn)低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| dCas9蛋白 |
Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3 |
100 µg |
1081066 |
| 500 µg |
1081067 |
8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當(dāng)使用原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備對(duì)RNP的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而提高基因編輯效率。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| 電穿孔Enhancer |
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer |
2 nmol |
1075915 |
| 10 nmol |
1075916 |
9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細(xì)胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
| 類型 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| HDR Enhancer |
Alt-R® HDR Enhancer |
100 µL |
1081072 |
| 500 µL |
1081073 |
10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸：專門為同源重組修復(fù)基因敲入開發(fā)，具有比標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率，可同時(shí)用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
Alt-R® CRISPR-Cas9優(yōu)勢
1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高基因編輯性能
以HPRT基因中的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，通過二代測序檢測總的基因編輯效率，結(jié)果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。
2、化學(xué)修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性
以HPRT1的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）RNA，轉(zhuǎn)染可高效表達(dá)化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞，24小時(shí)后，測定常見應(yīng)激反應(yīng)基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達(dá)水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFIT1，而Alt-R® RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對(duì)OAS2的誘導(dǎo)可測，而Alt-R® RNA處于基線。同時(shí)IFITM1、RIGI、OAS1等3個(gè)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因均得到相似結(jié)果，說明Alt-R® RNA不會(huì)激活細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。
3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特異性切割
4、電穿孔Enhancer，提高轉(zhuǎn)染效率，尤其是原代細(xì)胞等較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復(fù)合體），通過Lonza Nucleofector 核轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（A）、Jurkat細(xì)胞（B）、HEK-293細(xì)胞（C）時(shí)，使用電穿孔Enhancer（深藍(lán)色）、不使用（淺藍(lán)色）的實(shí)驗(yàn)效率。
5、HDR Enhancer，提高同源重組修復(fù)效率
①提高多種細(xì)胞HDR
以人HPRT為靶點(diǎn)，使用Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝），加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復(fù)DNA模板，轉(zhuǎn)染人多種細(xì)胞系。電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基中（綠色），或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照（棕色），HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時(shí)，Jurkat、K562培養(yǎng)72小時(shí)，通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、靶序列PCR進(jìn)行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細(xì)胞類型的同源重組修復(fù)效率。
②提高多種基因HDR
以人基因組多個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，將4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基（藍(lán)色）、含有DMSO的培養(yǎng)基（綠色）、未處理的培養(yǎng)基（棕色），48-72小時(shí)后，通過RFLP、PCR進(jìn)行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設(shè)計(jì)工具，方便地設(shè)計(jì)高質(zhì)量的crRNA/sgRNA/同源重組修復(fù)DNA模板/引物等
如物種的基因組富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點(diǎn)不適合，IDT同時(shí)提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，盡可能滿足基因編輯需求。
Cas9和Cas12a系統(tǒng)區(qū)別和應(yīng)用
| IDT Alt-R® CRISPR |
Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng) |
Alt-R® CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng) |
| Alt-R® Cas9核酸酶 |
Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶 |
Alt-R® Cas9 D10A切口酶 |
Alt-R® Cas9 H840A切口酶 |
Alt-R® dCas9蛋白 |
Alt-R® Cas12a核酸酶 |
| 特點(diǎn) |
通用Cas9酶，易于使用且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠 |
經(jīng)序列優(yōu)化的Cas9酶，提高中靶率，降低脫靶率，高性價(jià)比 |
突變的Cas9酶，在RuvC-like結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變，使其缺失在非靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，在HNH結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變，使其缺失在靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，僅結(jié)合靶向DNA，缺失核酸酶切割能力 |
通用Cas12a酶，富含AT的物種，或使用CRISPR-Cas9有限制 |
| PAM識(shí)別 |
NGG |
TTTV或TTTN |
| DNA切割 |
雙鏈 |
雙鏈 |
靶向鏈 |
非靶向鏈 |
\ |
雙鏈 |
| 末端 |
平末端 |
5’突出 |
3’突出 |
\ |
5’突出 |
| 建議用途 |
一般基因編輯實(shí)驗(yàn) |
滿足大多數(shù)CRISPR基因編輯需求，兼顧效率和成本 |
適用于同時(shí)使用2種crRNA，各自識(shí)別并切割2條鏈中一條，通過將spacer由20nt提高到40nt，實(shí)現(xiàn)更高特異性 |
基因沉默，CRISPR干擾CRISPRi |
無法使用Cas9的基因編輯實(shí)驗(yàn) |
| 規(guī)格 |
100 μg或500 μg |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），16nt通用序列 |
\ |
| tracrRNA |
67nt通用序列 |
\ |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），80nt通用序列，經(jīng)過序列修飾，不會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，不會(huì)激活無關(guān)的基因 |
\ |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
\ |
20-24nt特異性序列（推薦使用21nt），20nt通用序列 |
注：
N=任意堿基
V=A、C、G
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——IDT中國一級(jí)代理商，北京澤平