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NEB DNA連接酶
——重組T4 DNA連接酶、T4快速連接酶、T7 DNA連接酶

 
北京澤平代理的美國進口NEB DNA連接酶，包括T4 DNA連接酶、T4 DNA 快速連接酶試劑盒、T7 DNA連接酶、電轉(zhuǎn)連接酶等，覆蓋平末端連接酶、T/A連接酶、無縫克隆連接酶、快速連接酶等廣泛類型，為生命科學(xué)實驗中分子克隆相關(guān)應(yīng)用提供豐富、高效的連接酶選擇。

NEB T4 DNA 連接酶作為NEB優(yōu)勢產(chǎn)品，連接效率高、穩(wěn)定性強，滿足傳統(tǒng)酶切克隆、Golden Gate 組裝無縫克隆、TA克隆在內(nèi)的各類克隆需求，成為DNA連接酶的理想選擇。



①高性能——NEB T4 連接酶可實現(xiàn)10min連接粘性末端、2h連接平末端（或高濃度連接酶10min連接平末端）、5min快速連接粘性末端或平末端等，連接性能非常高效。

②種類豐富——NEB針對不同實驗需求進行配方優(yōu)化，提供耐鹽、耐熱、電轉(zhuǎn)連接酶等多種類型，以應(yīng)對復(fù)雜實驗需求。

③質(zhì)控嚴格——NEB DNA 連接酶具備非常高的酶純度、連接活性高、無其他酶干擾、質(zhì)控嚴格，產(chǎn)品質(zhì)量報告COA除提供連接酶活性、SDS-PAGE純度外，更對內(nèi)切酶、外切酶活性進行驗證，保證產(chǎn)品質(zhì)量高水準(zhǔn)。




1、NEB T4 DNA 連接酶

NEB T4 DNA 連接酶（T4 DNA Ligase，貨號M0202），是重組連接酶，可連接平末端、粘性末端，還可修補雙鏈DNA和部分DNA/RNA 雜交鏈中的單鏈切刻位點，適用于高復(fù)雜性文庫克隆。室溫（20~25℃）條件下，連接粘性末端，在20µl反應(yīng)體系中加入1µl T4 DNA 連接酶，反應(yīng)10min；連接平末端，在20µl的反應(yīng)體系中加入1µl的T4 DNA 連接酶，反應(yīng)2h，或者加入1µl高濃度的T4 DNA 連接酶反應(yīng)10min�？商峁〨MP級別產(chǎn)品。

 
2、NEB快速連接試劑盒

NEB快速連接試劑盒（Quick Ligation Kit，貨號M2200），作為快速T4連接酶，對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，在室溫條件下（25℃），可在5min內(nèi)連接粘性末端或平末端DNA片段，時間過長并不會提高連接效率。


圖. 時間連接進程。LITMUS 28i 載體經(jīng)EcoRV（平末端）或HindIII（粘性末端）切割后，用小牛腸磷酸酶進行處理和凝膠純化。使用NEB快速連接試劑盒將HaeIII消化后的ΦX174 DNA插入片段（平末端）和HindIII消化后的λ DNA 插入片段（粘性末端）連接到各自的載體中，插入片段與載體的比例3:1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH-5α細胞中，并在37℃條件下LB-amp平板上過夜培養(yǎng)。

 
3、NEB平末端/TA連接酶預(yù)混液

NEB平末端/TA連接酶預(yù)混液（Blunt/TA Ligase Master Mix，貨號M0367），即用型2×預(yù)混液，內(nèi)含T4 DNA 連接酶、連接增強劑和經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，專為提高平末端和單堿基突出末端的連接效率和轉(zhuǎn)化效率而設(shè)計。


圖. 平末端/TA連接酶預(yù)混液提高了反應(yīng)通常較慢的末端連接的產(chǎn)量。在所有反應(yīng)條件下，使用高濃度T4 DNA 連接酶、快速連接試劑盒、平末端/TA預(yù)混液的最終連接產(chǎn)物產(chǎn)量。切刻位點、粘性末端和3'單堿基突出末端的底物溫育15min進行連接； 5'單堿基突出末端的底物溫育1h進行連接。

 
4、NEB瞬時粘性末端連接酶預(yù)混液

NEB瞬時粘性末端連接酶預(yù)混液（Instant Sticky-end Ligase Master Mix，貨號M0370），即用型2×預(yù)混液，內(nèi)含T4 DNA 連接酶、連接增強劑，優(yōu)化了酶和緩沖液組分的比例，專為瞬時連接粘性末端（2~4 bp）和提高轉(zhuǎn)化率設(shè)計。當(dāng)DNA量少且濃度較低時，仍可進行亞克隆連接，節(jié)省寶貴的DNA樣本，并且無需稀釋，可直接轉(zhuǎn)化到多種化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌菌株中。

 
5、NEB電轉(zhuǎn)連接酶

NBE電轉(zhuǎn)連接酶（ElectroLigase，貨號M0369），由T4 DNA 連接酶和經(jīng)優(yōu)化的即用型2×反應(yīng)緩沖液組成，內(nèi)含連接增強劑，不含PEG，專業(yè)用于促進各種DNA末端（平末端、粘性末端、TA末端）的高效連接和電轉(zhuǎn)化，可在低DNA濃度的小體系中進行亞克隆連接，節(jié)省寶貴的DNA樣品，無需純化或稀釋，反應(yīng)液可直接轉(zhuǎn)化到多種電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌菌株中，也可用于化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌菌株。


圖. 使用電轉(zhuǎn)連接酶建立連接反應(yīng)體系，內(nèi)含等量的（20ng載體和3倍摩爾量的插入片段）平末端（A）、T/A（B）或粘性末端（C）載體/插入片段，并溫育如圖所示的相應(yīng)時間。熱失活后，每個反應(yīng)取2μl直接轉(zhuǎn)化到NEB 10-beta 電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌中。取50μl的復(fù)蘇菌液（某些情況下需要稀釋）涂到選擇性培養(yǎng)板上，37℃ 溫育過夜。最后統(tǒng)計菌落。


6、NEB Hi-T4 耐熱DNA連接酶

NEB Hi-T4 耐熱DNA連接酶（Hi-T4 DNA Ligase，貨號M2622），是經(jīng)基因工程改造的T4 DNA 連接酶的變體，改善了熱穩(wěn)定性，可在高達50℃條件下連接平末端和粘性末端，還可修補雙鏈DNA、RNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。


圖. Hi-T4耐熱DNA連接酶的耐熱性優(yōu)于T4 DNA 連接酶。400單位T4 DNA 連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶在無DNA底物的1×T4 DNA 連接酶緩沖液中，以45℃預(yù)溫育指定時長。加入0.12μM HindIII（粘性末端）熒光標(biāo)記片段，并以37℃溫育15min，測試連接酶的剩余活性。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分析。T4 DNA 連接酶在45℃時逐漸失去活性，而Hi-T4耐熱DNA連接酶即使在45℃溫育72h后在連接粘性末端底物上仍保持完整活性。


圖. Hi-T4耐熱DNA連接酶對更高溫度循環(huán)的耐受性優(yōu)于T4 DNA 連接酶。在1×T4 DNA 連接酶緩沖液中，分別用1000單位T4 DNA 連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶與DNA（1μg pBR322）進行循環(huán)溫浴。循環(huán)溫度設(shè)置為：42℃（A）或50℃（B）5min，16℃ 5min。在指定的循環(huán)次數(shù)（0、15、30、45或60次）之后，以熒光標(biāo)記的粘性末端底物（HindIII突出末端，25℃時10min）檢測連接酶活性。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分析。顯示了連接酶的剩余活性（相對于0循環(huán)數(shù)據(jù)點）。
A：在16℃和42℃條件下，T4 DNA 連接酶經(jīng)過循環(huán)后逐漸失去活性（金黃線），而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經(jīng)過60次循環(huán)后仍保持活性（橙紅線）。
B：在16℃和50℃的15次循環(huán)后，T4 DNA 連接酶完全失去活性（金黃線），而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經(jīng)過60次循環(huán)后仍保持約60%的活性（橙紅線）。


7、NEB Salt-T4 耐鹽DNA連接酶

NEB Salt-T4 耐鹽DNA連接酶（Salt-T4 DNA Ligase，貨號M0467），是經(jīng)基因工程改造的T4 DNA 連接酶的變體，具備更強的耐鹽性，反應(yīng)體系中高達300mM的鹽濃度不影響連接酶活性。該酶不僅能夠連接平末端和粘性末端，還可修補雙鏈DNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。


圖. 與T4 DNA 連接酶相比，Salt-T4耐鹽DNA連接酶對粘性末端底物表現(xiàn)出更高的耐鹽性。取400單位的T4 DNA 連接酶或Salt-T4耐鹽DNA連接酶與0.12μM熒光標(biāo)記的HindIII酶切片段（粘性末端），在鹽量梯度（0~1000mM NaCl）的1×T4 DNA 連接酶緩沖液中25℃溫育10min。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分析。當(dāng)鹽濃度超過200mM時，T4 DNA 連接酶的活性迅速喪失；當(dāng)鹽濃度高達500mM時，Salt-T4耐鹽DNA連接酶連接粘性末端底物時仍保留>60%的活性。


8、NEB T3 DNA 連接酶

NEB T3 DNA 連接酶（T3 DNA Ligase，貨號M0317），來源于T3噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，對NaCl的耐鹽性是T4 DNA 連接酶的2倍，可用于粘性末端、平末端、切刻位點的連接，與T4 DNA 連接酶一樣，在反應(yīng)中加入PEG 6000 可以提高平末端連接效率。


9、NEB T7 DNA 連接酶

NEB T7 DNA 連接酶（T7 DNA Ligase，貨號M0318），來源于T7噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，僅可連接粘性末端，不能連接平末端，適用于當(dāng)DNA平末端和粘性末端同時存在，而僅需連接粘性末端時。


圖. T7 DNA 連接酶不會連接平末端DNA片段。每種底物取200ng，每種連接酶取1μl，建立包含平末端片段（Φ X174 DNA-HaeIII Digest）和粘性末端片段（λ DNA-HindIII Digest）的連接反應(yīng)體系，并在相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液中以25℃溫育30min。添加6×上樣染料立即終止反應(yīng)，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，再利用溴化乙錠進行染色。


10、NEB Taq 高保真DNA連接酶

NEB Taq 高保真DNA連接酶（HiFi Taq DNA Ligase，貨號M0647），由熱穩(wěn)定DNA連接酶和添加劑組成，在高溫（37~75℃）范圍內(nèi)具有活性，多次熱循環(huán)后仍保持活性，能以非常高的保真度高效連接DNA切刻，適用于依賴連接酶的IVD技術(shù)（如連接酶鏈反應(yīng)LCR、連接酶檢測反應(yīng)LDR），可降低錯配連接。

Taq高保真DNA連接酶能高效區(qū)分連接處兩側(cè)的堿基是否正確配對，適用于3'或5'錯配檢測，可以更好地識別連接反應(yīng)供體和受體，精確檢測SNP和其它等位基因變異。相比之下，其它熱穩(wěn)定連接酶只對3'錯配有效。Taq高保真DNA連接酶可提供無甘油劑型。Taq高保真連接酶不能替代T4 DNA 連接酶，不適用于克隆應(yīng)用或接頭連接/NGS文庫制備。


11、NEBridge連接酶預(yù)混液

NEBridge連接酶預(yù)混液（NEBridge Ligase Master Mix，貨號M1100），專用于Golden Gate 無縫克隆，作為即用型3×預(yù)混液，含有T4 DNA 連接酶和連接增強劑，可與多種NEB IIS型限制性內(nèi)切酶搭配使用，進行高效率、高保真的Golden Gate 組裝，支持在單個反應(yīng)中同時進行2~52個片段的組裝，可用于單片段克隆和文庫構(gòu)建。




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