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NEB無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)
——NEBExpress、PURExpress體外蛋白合成試劑盒
 

北京澤平代理美國進(jìn)口New England Biolabs（NEB）品牌無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，包括NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)、PURExpress體外蛋白合成試劑盒，以提供更快速、更簡單、更高效的蛋白表達(dá)平臺選擇。



無細(xì)胞表達(dá)是一種不使用活細(xì)胞的蛋白表達(dá)方法。在無細(xì)胞表達(dá)中，使用一種包含指導(dǎo)蛋白合成所需的所有成分的溶液（如核糖體、tRNA、酶、輔因子、氨基酸等），來轉(zhuǎn)錄和翻譯核酸模板（如質(zhì)粒DNA、線性DNA、mRNA）。無細(xì)胞表達(dá)只需一個簡單的生化反應(yīng)，就可以在幾小時內(nèi)生成目的蛋白，而基于細(xì)胞的蛋白表達(dá)方法則通常需要幾天甚至更長時間。

無細(xì)胞表達(dá)適用于多種應(yīng)用場景，其速度和便捷性促進(jìn)了高通量蛋白表達(dá)在蛋白質(zhì)工程、突變研究和酶篩選等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，無細(xì)胞表達(dá)也常用來制備用于生物物理和結(jié)構(gòu)功能分析的蛋白。無細(xì)胞表達(dá)的其它應(yīng)用包括生產(chǎn)對宿主細(xì)胞有毒的蛋白、表達(dá)含有修飾或非天然氨基酸的蛋白，以及摻入翻譯后修飾。由于其穩(wěn)健的性能、可放大性和成本效益，無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也被應(yīng)用于代謝工程和合成生物學(xué)。

NEB目前提供兩種性能優(yōu)異的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中基于細(xì)胞裂解液的NEBExpress系統(tǒng)表現(xiàn)出高表達(dá)水平和高性價比，而PURExpress系統(tǒng)組分明確，高度可控，可滿足多種應(yīng)用場景。


NEB無細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程更簡單，更快速

圖. 傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)純化與NEB無細(xì)胞表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)流程比較。
1、基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)流程：將重組質(zhì)粒純化后轉(zhuǎn)化到合適的宿主菌株中，涂到平板上并過夜培養(yǎng)。第二天挑取菌落并在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物重新稀釋，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD=0.4~0.8），然后誘導(dǎo)表達(dá)。第二天，將培養(yǎng)物離心沉淀、裂解，并通過柱層析進(jìn)行純化。
2、NEB無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程：將重組質(zhì)粒純化，加入到NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)混合物中，溫育數(shù)小時，與NEBExpress Ni-NTA 磁珠混合，并上樣到磁性顆粒處理器進(jìn)行自動化純化。

 
NEB無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢

·不依賴于細(xì)胞的生長與存活；
·簡單、快速、高性價比；
·體系可放大；
·兼容高通量實(shí)驗(yàn)流程；
·開放系統(tǒng)：生產(chǎn)毒性蛋白，摻入非天然氨基酸，加入蛋白折疊輔助因子，模板類型更靈活。


 

一、NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)

NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)將轉(zhuǎn)錄和翻譯整合為一體，設(shè)計用于以DNA或mRNA為模板，在T7 RNA 聚合酶啟動子的控制下合成蛋白。該系統(tǒng)表達(dá)水平高，能夠表達(dá)高分子量蛋白，可擴(kuò)大規(guī)模，并在高通量表達(dá)應(yīng)用中降本增效。該系統(tǒng)的速度和穩(wěn)健性可促進(jìn)蛋白表達(dá)，助力蛋白質(zhì)工程、突變研究和酶篩選等相關(guān)應(yīng)用研究。

NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)提供模板DNA之外合成蛋白所需的所有成分，只需加入模板DNA即可進(jìn)行蛋白表達(dá)。該系統(tǒng)由基因工程菌株中提取的高活性細(xì)胞提取物、反應(yīng)緩沖液和優(yōu)化的T7 RNA 聚合酶組合而成，可協(xié)同完成分子量從17~230kDa不同大小蛋白的高效表達(dá)。

 
NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)優(yōu)勢

·蛋白表達(dá)產(chǎn)量高（通常為0.5mg/ml，最高可達(dá)3mg/ml）；
·蛋白可在大約2~4h內(nèi)合成和可視化；
·包含T7 RNA 聚合酶以及用于目標(biāo)模板DNA轉(zhuǎn)錄/翻譯的所有組分；
·可表達(dá)分子量17~230kDa的蛋白；
·模板可以是質(zhì)粒DNA、線性DNA或mRNA；
·試劑盒提供RNase抑制劑，可抑制RNase污染，使RNA更加穩(wěn)定；
·靈活的反應(yīng)條件能使產(chǎn)量更大化，蛋白表達(dá)可以在37℃下持續(xù)10h或在更低的溫度下持續(xù)24h。

 
應(yīng)用

·快速合成分析量級蛋白，用于下一步表征分析；
·高通量篩選和液體處理；
·表位作圖和蛋白質(zhì)折疊；
·表達(dá)毒性蛋白。

圖. NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)可用于表達(dá)多種不同大�。�17~230kDa）的蛋白。250ng模板DNA在50μl反應(yīng)體系中37℃溫育3h。紅點(diǎn)處指示目的蛋白。M=非預(yù)染蛋白Standard，“neg”=陰性對照，無模板DNA。

圖. NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，經(jīng)純化后，可獲得足夠量的蛋白用于下游分析。兩個50μl NEBExpress無細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)，表達(dá)His標(biāo)簽鳥苷酸激酶（GMK）和 His標(biāo)簽綠色熒光蛋白（vGFP），并按照推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程使用NEBExpress鎳離心柱純化。各泳道樣品情況：純化前樣品（Load）、未結(jié)合流出液（Flow）、非特異性結(jié)合部分（Wash）、結(jié)合并純化后的樣品（Elute）。最終50μl洗脫液的蛋白濃度為0.5mg/ml，證明無細(xì)胞蛋白表達(dá)可以產(chǎn)生足夠量的蛋白用于功能和結(jié)構(gòu)表征。

使用NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)，大約3h即可檢測到目標(biāo)蛋白的高產(chǎn)量表達(dá)。如果有足夠的通氣和攪拌，反應(yīng)可以持續(xù)10h以上，從而表達(dá)超過1mg/ml的蛋白。當(dāng)在較溫和的溫度下進(jìn)行蛋白表達(dá)反應(yīng)時，較長的溫育時間有益于產(chǎn)量增加。在25°C下，vGFP的表達(dá)可持續(xù)超過24h，實(shí)現(xiàn)約為3mg/ml的高產(chǎn)量。

圖. NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)，可通過延長溫育時間，實(shí)現(xiàn)更高的蛋白產(chǎn)量。
A. 在25℃、30℃、37℃下對vGFP進(jìn)行無細(xì)胞表達(dá)，vGFP熒光強(qiáng)度在25℃，24h后達(dá)到最大。
B. 終點(diǎn)熒光值表明，與37℃（16h）下的無細(xì)胞表達(dá)相比，在較低溫度下溫育更長時間（25℃，24h）可實(shí)現(xiàn)明顯更高的產(chǎn)量。

圖. 當(dāng)以線性DNA為模板時，NEBExpress GamS 核酸酶抑制劑可提高NEBExpress無細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)量。GamS抑制核酸外切酶V（RecBCD）的活性，并穩(wěn)定大腸桿菌體外蛋白表達(dá)反應(yīng)中的線性DNA模板。50μl反應(yīng)體系中包含100ng線性DNA模板、NEBExpress無細(xì)胞E.coli蛋白合成系統(tǒng)組分、1.5μg NEBExpress GamS 核酸酶抑制劑，37℃溫育5h，并通過熒光信號監(jiān)測活性。

 

 

 

 
二、PURExpress體外蛋白合成試劑盒

NEB PURExpress 體外蛋白合成試劑盒是新型無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，用于基因快速表達(dá)分析，由純化后的大腸桿菌翻譯所必需的組分構(gòu)成。僅需將兩管試劑混合后加入模板DNA，即可合成一系列無修飾或降解的蛋白。NEB PURExpress 系統(tǒng)幾個小時就可獲得蛋白，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時間，特別適合高通量技術(shù)。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特定試劑盒型號。

1、PURExpress體外蛋白合成試劑盒是一種綜合包含所有組分的試劑盒。
2、PURExpress Δ Ribosome 試劑盒支持用戶在進(jìn)行蛋白翻譯實(shí)驗(yàn)時，添加自己設(shè)計的核糖體。
3、PURExpress Δ RF123 試劑盒中，三種釋放因子單獨(dú)提供，支持用戶在進(jìn)行蛋白合成反應(yīng)/核糖體展示實(shí)驗(yàn)時，選擇是否添加釋放因子，或添加另外的釋放因子。
4、PURExpress Δ (aa, tRNA) 試劑盒可用于添加經(jīng)過修飾的氨基酸和tRNA混合物來進(jìn)行蛋白表達(dá)反應(yīng)。
5、PURExpress二硫鍵增強(qiáng)劑可用于促進(jìn)目標(biāo)蛋白正確二硫鍵的形成。

圖. 使用PURExpress系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化示意圖。

 
NEB PURExpress 體外蛋白合成試劑盒特性

·適用于環(huán)狀或線性DNA模板；
·合成的蛋白可直接通過考馬斯亮藍(lán)凝膠電泳觀察；
·約2h即可完成蛋白表達(dá)；
·模板可以是質(zhì)粒DNA、線性DNA或mRNA；
·轉(zhuǎn)錄/翻譯的組分可通過親和層析去除；
·包含T7 RNA 聚合酶以及用于目標(biāo)模板DNA轉(zhuǎn)錄/翻譯的所有組分。


NEB PURExpress 系統(tǒng)包含以下組分

·帶有His標(biāo)簽的翻譯因子（起始因子IF1、IF2、IF3；延伸因子EF-Tu、EF-Ts、EF-G；釋放因子RF1、RF2、RF3；核糖體回收因子；20種氨酰tRNA合成酶；甲硫氨酰tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶）；
·大腸桿菌核糖體；
·大腸桿菌tRNA
·能量再生系統(tǒng)；
·NTP、氨基酸、鹽、緩沖液；
·重組T7 RNA 聚合酶。


應(yīng)用

·合成分析量級的蛋白用于進(jìn)一步表征；
·確定開放閱讀框；
·合成截短蛋白用于活性結(jié)構(gòu)域和功能性殘基的鑒定；
·在合成的蛋白中摻入修飾的、非天然的或標(biāo)記的氨基酸；
·核糖體結(jié)構(gòu)與功能研究；
·釋放因子功能研究/核糖體展示；
·表位作圖。


圖. 使用NEB PURExpress 體外蛋白合成試劑盒表達(dá)蛋白。根據(jù)說明書建立反應(yīng)體系。紅點(diǎn)處指示目的蛋白。Marker M 是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。

圖. 高純度的PUREXpress體外蛋白合成系統(tǒng)能夠經(jīng)受多次凍融循環(huán)而保留活性，不降低反應(yīng)效率。PURExpress系統(tǒng)溶液A和B經(jīng)過四輪凍融處理后，根據(jù)說明書建立標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)。紅點(diǎn)表示目的蛋白。Marker M 是NEB寬范圍蛋白Marker。

NEB PURExpress 二硫鍵增強(qiáng)劑促進(jìn)蛋白的正確折疊。

圖. PURExpress二硫鍵增強(qiáng)劑（PDBE）促進(jìn)活性vtPA的正確折疊。以vtPA DNA 為模板，按照PURExpress系統(tǒng)說明書建立反應(yīng)，37℃下溫育2小時后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行活性檢測，在1h內(nèi)監(jiān)測發(fā)光底物的剪切反應(yīng)。

 

 


PURExpress與NEBExpress無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用選擇
 

北京澤平代理的無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)品
 

 
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