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NEB NGS二代測序DNA建庫試劑
——DNA建庫試劑盒，U形測序接頭


北京澤平代理美國進口NEB（New England Biolabs）公司NGS二代測序用DNA建庫試劑，提供NEBNext系列文庫構(gòu)建試劑盒、U型接頭（環(huán)形測序接頭，adapter）等，包括NEBNext Ultra II DNA 建庫試劑盒、EM-seq甲基化建庫試劑盒、FFPE DNA 建庫試劑盒、接頭引物試劑盒，提供核酸提取純化、酶法片段化、文庫制備的整體解決方案，應(yīng)用于Illumina、MGI華大智造測序儀及其他二代測序平臺，以進行全基因組測序、外顯子測序、甲基化測序、FFPE DNA 測序等。使用NEB建庫試劑盒，即使低起始量（低至0.1ng DNA）、低質(zhì)量樣本（FFPE樣本），也能獲得高產(chǎn)量、高質(zhì)量文庫。NEB試劑性能穩(wěn)定，實驗結(jié)果具備高重現(xiàn)性。NEBNext測序產(chǎn)品自2009年上市以來，被≥15,000篇文獻引用。



NEBNext測序試劑盒（Kit）包括了整個文庫制備流程所需的全部試劑，許多試劑盒提供純化和片段篩選用磁珠。NEBNext模塊（Module）僅包含文庫制備其中一個步驟所需試劑，一系列NEBNext模塊可組合用于文庫制備流程，滿足特殊實驗需求。接頭和引物模塊大部分單獨提供，應(yīng)用更靈活。

 
一、全基因組測序、外顯子測序建庫試劑盒（Illumina用）

1、NEBNext Ultra II FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶（NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina，貨號E7805）將DNA片段化、末端修復(fù)、加dA尾優(yōu)化到一步，在單管中完成，無論起始量或GC含量如何，均采用相同的片段化操作流程。接頭和引物未隨試劑盒提供，須單獨購買。

·使用同一種酶混合物即可完成DNA片段化、末端修復(fù)、加dA尾三個步驟；
·DNA起始量范圍廣，100pg~500ng的起始量均可制備高質(zhì)量文庫，無需擴增步驟；
·精簡的實驗流程將時間縮短至約2.5h，實際手動操作時間<15min；
·提高反應(yīng)效率，減少樣本損失，獲得高產(chǎn)量文庫；
·不同起始量或GC含量的DNA樣本，均可使用相同的打斷流程；
·可通過改變酶切孵育時間獲得不同大小的DNA片段；
·起始DNA可溶于水或標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（Tris-His或TE），降低樣本準(zhǔn)備難度。


圖. 使用NEB ULTRA II FS DNA 文庫制備試劑盒獲得的DNA文庫產(chǎn)量比其他方法多10~15倍，數(shù)據(jù)來自Wellcome Trust Sanger Institute 的Peter Ellis。以人類基因組DNA為樣本，分別使用現(xiàn)有的DNA建庫工作流程（CURRENT）、NEB Ultra II 和 NEB Ultra II FS 文庫制備試劑盒進行DNA建庫。將已連接接頭的文庫經(jīng)過PCR（4~12個循環(huán)）擴增，純化后使用 Agilent Bioanalyzer 平臺進行定量。DNA文庫產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值為經(jīng)過12個PCR循環(huán)擴增獲得。

此外，NEB還提供包含SPRIselect磁珠的NEBNext Ultra II FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶含純化磁珠（貨號E6177），用于片段篩選和純化，具備更強的靈活性和可靠性。

 
2、NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒（NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina，貨號E7645）適用于已打斷的的DNA片段建庫，試劑盒每種組分都經(jīng)過了重新優(yōu)化配制，能夠用500pg低起始量的DNA構(gòu)建高質(zhì)量文庫�？焖佟⒕�簡、自動化的實驗流程，在降低PCR循環(huán)數(shù)的同時提高了GC覆蓋度。該試劑盒與PCR-free實驗流程兼容，且對于難以建庫的樣本（如FFPE樣本），也有很好的效果。

·更高的文庫產(chǎn)量，滿足更多實驗所需；
·DNA起始量范圍廣，500pg~1µg的起始量均可制備高質(zhì)量文庫;
·各種類型的DNA樣本均可制備文庫，包括高GC含量的DNA、FFPE DNA 樣本；
·提高靶向富集應(yīng)用的產(chǎn)量和質(zhì)量；
·250ng~1000ng的完整DNA均可制備高質(zhì)量文庫，無需擴增步驟；
·更少的PCR循環(huán)數(shù)，更高的文庫復(fù)雜性；
·流程化的操作設(shè)計，減少手動操作時間，與自動化兼容。


圖. 對于不同GC含量和起始量的微生物基因組DNA，NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒能獲得均一的GC覆蓋度。以500pg、1ng、100ng基因組DNA為起始樣本，使用Ultra II DNA 文庫制備試劑盒進行建庫后，通過Illumina MiSeq 測序。使用Bowtie 2.2.4 將reads進行比對，并使用Picard's CollectGCBiasMetrics（v1.117）計算GC覆蓋度。預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)化覆蓋度（1.0）以灰色水平線表示，不同GC%中100bp區(qū)域的數(shù)量以灰色條形圖顯示，不同顏色折線圖表示標(biāo)準(zhǔn)化后的文庫覆蓋度。

同時，NEB提供包含SPRIselect磁珠的NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒含純化磁珠（貨號E7103），以提高實驗的靈活性和可靠性。



 
3、NEBNext UltraExpress 超快速FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶（NEBNext UltraExpress FS DNA Library Prep Kit，貨號E3340），具有快速、精簡的實驗流程，僅需一管酶混合物即可完成酶法片段化、末端修復(fù)、加dA尾。采用預(yù)混試劑，減少孵育時間，減少純化步驟。針對不同的樣本起始量，2h內(nèi)均可制備出高產(chǎn)量、高質(zhì)量文庫。不論多少起始量都使用同一個實驗流程，幾乎適合所有樣本。

·更快速的實驗流程（<2h），包含酶法片段化；
·更少的步驟，單管即可完成反應(yīng)；
·更少的純化步驟；
·起始量范圍廣，10ng~200ng完整的DNA均可制備高質(zhì)量的文庫；
·一個實驗流程，可適用于不同起始量；
·兼容自動化工作流程。


圖. NEBNext UltraExpress 超快速FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶工作流程。


4、NEBNext UltraExpress 超快速DNA文庫制備試劑盒（NEBNext UltraExpress DNA Library Prep Kit，貨號E3325），使用更快速、簡化的實驗流程，針對不同的起始量（10ng~200ng打斷的DNA），2h內(nèi)皆可制備出高產(chǎn)量、高質(zhì)量文庫。包含預(yù)混試劑，減少反應(yīng)時間和純化步驟，整個文庫制備流程在單管中完成。對所有DNA起始量使用同一個實驗流程，幾乎適合所有樣本。 

·更快速的實驗流程（<2h）；
·更少的純化步驟；
·起始量范圍廣，10ng~200ng已打斷的DNA均可制備高質(zhì)量的文庫；
·一個實驗流程，適用于不同起始量；
·兼容自動化工作流程；


圖. NEBNext UltraExpress 超快速DNA文庫制備實驗流程。

 

 

 

 
二、甲基化建庫試劑盒（Illumina用）

1、NEBNext酶學(xué)轉(zhuǎn)化法甲基化建庫試劑盒v2（EM-seq v2，NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 Kit，貨號E8015）提供的高性能酶學(xué)轉(zhuǎn)化法，能夠代替重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法來檢測5mC和5hmC，并更大程度降低對DNA的損傷，從有限的測序數(shù)據(jù)中更靈敏地檢測胞嘧啶甲基化。與第一代試劑盒相比，該試劑盒的起始量范圍更廣（低至100pg），實驗流程更精簡，速度更快。試劑盒包含轉(zhuǎn)化試劑、文庫制備試劑和EM-seq接頭。NEB單獨提供多組Unique雙端Index引物，能夠更靈活地實現(xiàn)多重檢測。

·更優(yōu)秀的5mC和5hmC檢測靈敏度；
·起始量范圍廣，0.1ng~200ng；
·可從有限的測序數(shù)據(jù)檢測到更多的CpG位點；
·更均一的GC覆蓋度；
·更高對比率；
·更高效的建庫流程，更長的文庫插入片段；
·單獨提供Index引物。


圖. EM-seq轉(zhuǎn)化原理。EM-seq是一種兩步酶學(xué)轉(zhuǎn)化法，可檢測修飾的胞嘧啶。第一步，TET2和T4-BGT保護修飾的胞嘧啶不會在下游實驗中被脫氨基。TET2酶促氧化5mC和5hmC，T4-BGT對5hmC進行糖基化。第二步，使用APOBEC將未經(jīng)修飾的胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，但5mC和5hmC在第一步中受到保護，不會被脫氨基。隨后使用NEBNext Q5U 預(yù)混液（Q5高保真DNA聚合酶的改良版）進行擴增，并在Illumina平臺上進行測序。用于重亞硫酸鹽測序的生物信息學(xué)分析工具也可用于EM-seq。


圖. 使用不同起始量進行建庫，EM-seq v2 均能獲得高CpG覆蓋度。使用0.1ng~200ng的NA12878 DNA（使用Covaris ME220 打斷至350bp）制備EM-seq v2 文庫，向其中摻入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文庫使用Illumina NovaSeq 6000（2×150 base）測序。使用bwa-meth將每個文庫的約9.1億reads與人類T2T、lambda和pUC19參考基因組的復(fù)合基因組進行比對。正義鏈和反義鏈上的CpG獨立計算，在T2T基因組中分析出多達6780萬個可能的CpG位點。使用1ng~200ng的起始樣本時，EM-seq v2 始終可以覆蓋超過5600萬個CpG位點；即使使用0.1ng起始樣本時，也可覆蓋約4500萬個CpG位點。


圖. 相較于WGBS和第一代EM-seq，NEBNext EM-seq v2 能在更低的測序覆蓋深度下識別更多的CpG位點。使用10ng和200ng的NA12878 DNA（打斷至約350bp）制備EM-seq v2、EM-seq和WGBS文庫，向其中摻入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文庫均使用Illumina NovaSeq 6000 測序。為了將第一代EM-seq和WGBS數(shù)據(jù)與EM-seq v2 數(shù)據(jù)進行準(zhǔn)確比較，使用bwa-meth將每個文庫的約6.25億個100 base reads 與人類T2T、lambda和pUC19參考基因組的復(fù)合基因組進行比對，并評估了這些reads。正義鏈和反義鏈上的CpG獨立計算，在T2T基因組中分析出多達6780萬個可能的CpG位點。使用10ng和200ng的起始樣本時，EM-seq v2 和EM-seq可以覆蓋超過5400萬個CpG位點；使用200ng和10ng起始樣本時，WGBS文庫在1×覆蓋度下分別僅覆蓋4600萬和3900萬個CpG 位點。虛線代表（A）10×和（B）8×的覆蓋度。圖表列出了不同文庫在（A）10×和（B）8×覆蓋度水平下覆蓋的CpG位點百分比。


圖. 使用不同起始量進行建庫，EM-seq v2 均能獲得高產(chǎn)量的文庫。將0.1ng~200ng NA12878 基因組DNA打斷至350bp（Covaris ME220），并用作EM-seq v2 的起始樣本，所使用的PCR循環(huán)數(shù)如圖所示。使用Agilent TapeStation 和High Sensitivity D1000 試劑測定文庫產(chǎn)量。顯示的數(shù)值是兩次技術(shù)性重復(fù)實驗的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：使用不同起始量進行建庫，EM-seq v2 均能獲得高產(chǎn)量的文庫。


圖. EM-seq v2 文庫能實現(xiàn)均一的GC覆蓋度。使用0.1ng~200ng的NA12878 DNA（使用Covaris ME220 打斷至350bp）制備EM-seq v2 文庫，向其中摻入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文庫使用Illumina NovaSeq 6000（2×150 base）測序。使用bwa-meth將每個文庫的約9.1億reads與人類T2T、lambda和pUC19參考基因組的復(fù)合基因組進行比對。使用Picard計算GC覆蓋度，圖中顯示將reads與人類基因組進行比對，不同GC含量時（0~100%），標(biāo)準(zhǔn)化后覆蓋度的分布情況。結(jié)果表明：使用不同起始量進行建庫，EM-seq v2 文庫均能獲得均一的GC覆蓋度。

 
2、NEBNext酶學(xué)轉(zhuǎn)化法5hmC甲基化建庫試劑盒（E5hmC-seq，NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Kit，貨號E3350）是一種在單堿基水平上特異性檢測5hmC位點的方法。使用兩步酶法轉(zhuǎn)化后經(jīng)Illumina測序檢測5hmC，能更大限度地減少對DNA的損傷，并可區(qū)分5hmC、5mC、胞嘧啶。該試劑盒的起始量為0.1ng~200ng，包含NEBNext Ultra II 文庫制備試劑和E5hmC-seq接頭，但不包含引物，需單獨購買。用于EM-seq v2 和重亞硫酸鹽測序的生物信息學(xué)分析工具也可用于E5hmC-seq。通過從EM-seq v2 數(shù)據(jù)中減去E5hmC-seq數(shù)據(jù)，可以確定單個5mC和5hmC位點的精確位置。

·優(yōu)秀的5hmC檢測靈敏度；
·起始量范圍廣，0.1ng~200ng；
·更均一的GC覆蓋度；
·更高效的建庫流程；
·E5hmC-seq和EM-seq數(shù)據(jù)結(jié)果可聯(lián)合分析。


圖. E5hmC-seq轉(zhuǎn)化原理。在兩步酶法轉(zhuǎn)化過程中，T4-BGT對5hmC進行糖基化，使得5hmC在下一步APOBEC脫氨基反應(yīng)中被保護了起來。T4-BGT不保護5mC和未甲基化的胞嘧啶，它們被APOBEC脫氨基為尿嘧啶。隨后使用NEBNext Q5U 預(yù)混液（Q5高保真DNA聚合酶的改良版）進行擴增，并在Illumina平臺上進行測序。


圖. 使用不同起始量進行建庫，E5hmC均能獲得高產(chǎn)量的文庫。使用Covaris ME220 儀器將0.1ng~200ng人腦基因組DNA打斷至350bp，并用作E5hmC-seq的起始樣本，所使用的PCR循環(huán)數(shù)如圖所示。使用Agilent TapeStation，High Sensitivity D1000 試劑測定文庫產(chǎn)量。顯示的數(shù)值是四次技術(shù)性重復(fù)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表明：不同起始量的樣本均能獲得高產(chǎn)量的E5hmC-seq文庫。


圖. E5hmC-seq文庫5hmC檢出率高。使用0.1ng~200ng人腦基因組DNA制備E5hmC-seq文庫時，插入所有胞嘧啶完全羥甲基化的T4 DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品。使用Covaris ME220 儀器將DNA打斷至350bp，并用作E5hmC-seq的起始樣本，構(gòu)建的文庫在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上進行測序。使用bwa-meth將每個文庫的19億數(shù)據(jù)（200ng、10ng、1ng）或7.15億數(shù)據(jù)（0.5ng、0.1ng）與人類T2T、lambda和T4參考基因組的復(fù)合基因組進行比對。使用MmethylDackel從比對結(jié)果中提取甲基化信息。顯示的數(shù)值是兩次技術(shù)性重復(fù)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表明：T4 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品CpG、CHG和CHH中的5hmC檢出率≥98.9%。


圖. 使用不同起始量人腦gDNA進行建庫，E5hmC表現(xiàn)出一致的總5hmC檢測結(jié)果。使用Covaris ME220 儀器將0.1ng~200ng人腦基因組DNA打斷至350bp，并用作E5hmC-seq的起始樣本，構(gòu)建的文庫在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上進行測序。使用bwa-meth將每個文庫的19億數(shù)據(jù)（200ng、10ng、1ng）或7.15億 數(shù)據(jù)（0.5ng、0.1ng）與人類T2T、lambda和T4參考基因組的復(fù)合基因組進行比對，并使用MmethylDackel從中提取甲基化信息。顯示的數(shù)值是兩次技術(shù)性重復(fù)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表明：不同起始量的樣本在CpG、CHH和CHG中的5hmC占比相似。


圖. E5hmC-seq文庫GC覆蓋度均一。使用Covaris ME220 儀器將0.1ng~200ng人腦基因組DNA打斷至350bp，并用作E5hmC-seq的起始樣本，構(gòu)建的文庫在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上進行測序。使用bwa-meth將每個文庫的19億數(shù)據(jù)（200ng、10ng、1ng）或7.15億數(shù)據(jù)（0.5ng、0.1ng）與人類T2T、lambda和T4 參考基因組的復(fù)合基因組進行比對。使用Picard計算GC覆蓋度，圖中顯示不同GC含量時（0~100%），標(biāo)準(zhǔn)化后覆蓋度的分布情況。將人類T2T基因組的GC含量分布繪制為直方圖。結(jié)果表明：不同起始量的樣本所制備的E5hmC-seq文庫皆能獲得均一的GC覆蓋度。


圖. 使用不同起始量進行建庫，E5hmC-seq均能獲得高GC覆蓋度。使用Covaris ME220 儀器將0.1ng~200ng人腦基因組DNA打斷至350bp，并用作E5hmC-seq的起始樣本。構(gòu)建的文庫在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上進行測序。使用bwa-meth將每個文庫的19億數(shù)據(jù)（200ng、10ng、1ng）或7.15億數(shù)據(jù)（0.5ng、0.1ng）與人類T2T、lambda和T4參考基因組的復(fù)合基因組進行比對。使用MmethylDackel從比對結(jié)果中提取甲基化信息，以methylkit形式提供報告。使用CpG結(jié)果，針對所有起始量的E5hmC-seq文庫生成CpG圖譜。正義鏈和反義鏈上的CpG獨立計算，在T2T基因組中分析出多達6780萬個可能的CpG位點。使用0.5ng~200ng的起始樣本時，E5hmC-seq始終可以覆蓋超過5600萬個CpG位點；即使使用0.1ng起始樣本時，也可覆蓋約4800萬個位點。

 

 

 

 
三、FFPE DNA 建庫試劑盒（Illumina用）

1、NEBNext UltraShear FFPE DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶（NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit，貨號E6655）采用專為FFPE DNA 優(yōu)化的NEBNext UltraShear 片段化酶進行酶切打斷，提高文庫產(chǎn)量和質(zhì)量，同時提高可擴展性和易用性。包含專為FFPE DNA 文庫制備所優(yōu)化的試劑和流程，可修復(fù)由FFPE過程造成的DNA損傷。簡化實驗流程，減少手動操作時間。不同起始量（5ng~250ng）和不同質(zhì)量樣本，均可提高文庫產(chǎn)量和質(zhì)量。

·包含特殊的打斷酶、FFPE DNA 修復(fù)液、專為FFPE DNA 文庫制備所優(yōu)化的試劑和流程；
·起始量范圍廣，5ng~250ng均可構(gòu)建文庫；
·提高文庫產(chǎn)量，滿足雜交捕獲靶向富集的需求；
·提高測序質(zhì)量；
·提高體細胞突變的檢測靈敏度；
·減少由于樣本固定、儲存和提取過程導(dǎo)致的FFPE DNA 樣本的脫氨和氧化損傷，減少假陽性突變；
·實驗流程簡化，減少手動操作時間，并設(shè)有多個可暫停節(jié)點。


圖. NEBNext UltraShear FFPE DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶實驗流程。實驗流程簡化，減少了手動操作時間，可使用5~250ng廣泛的起始量范圍。操作流程步驟經(jīng)過優(yōu)化，用戶可以在實驗流程中的任何步驟完成后暫停，并將反應(yīng)體系貯存在-20℃過夜而不影響文庫產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖. 針對不同起始量和不同質(zhì)量的樣本，NEBNext UltraShear FFPE DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能高效制備文庫。以5ng、50ng、250ng正常組織FFPE DNA 為起始量樣本制備文庫，其質(zhì)量范圍DIN值為1.8~6.8，使用的PCR循環(huán)數(shù)如圖所示。5ng和50ng起始量的樣本重復(fù)三次實驗，250ng起始量的樣本重復(fù)一次實驗。5ng和50ng起始量的樣本結(jié)果標(biāo)注了標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示：針對不同質(zhì)量和起始量的樣本，使用NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒均能提高文庫產(chǎn)量。大多數(shù)雜交捕獲流程要求文庫產(chǎn)量大于200ng，即便起始量低至 50ng時，使用NEBNext UltraShear FFPE DNA 文庫制備試劑盒制備的FFPE DNA 文庫也可獲得足夠的文庫產(chǎn)量。

 
2、NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒（NEBNext FFPE DNA Library Prep Kit，貨號E6650）專為已打斷的FFPE DNA 設(shè)計，不同起始量（5ng~250ng）和不同質(zhì)量的FFPE DNA 樣本，均可獲得更高的文庫產(chǎn)量和質(zhì)量。該試劑盒包含專為FFPE DNA 文庫制備所優(yōu)化的試劑和流程，用以修復(fù)由FFPE過程造成的DNA損傷。實驗流程簡化且使用方便，減少了手動操作時間。

·包含F(xiàn)FPE DNA 修復(fù)液和專為FFPE DNA 文庫制備所優(yōu)化的試劑和流程；
·起始量范圍廣，5ng~250ng均可構(gòu)建文庫；
·提高文庫產(chǎn)量，滿足雜交捕獲流程的需求；
·提高測序質(zhì)量；
·提高體細胞突變的檢測靈敏度；
·自動化適配的實驗流程。


圖. NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒實驗流程。實驗流程簡化，減少了手動操作時間。操作流程步驟經(jīng)過優(yōu)化，用戶可以在實驗流程中的任何步驟完成后暫停，并將反應(yīng)體系貯存在-20℃過夜而不影響文庫產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖. 針對不同起始量和不同質(zhì)量的樣本，NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒均能高效制備文庫。以5ng、50ng、250ng經(jīng)Covaris打斷的正常組織FFPE DNA 為起始樣本制備文庫，其質(zhì)量范圍DIN值為1.8~6.8，使用的PCR循環(huán)數(shù)如圖所示。5ng和50ng起始量的樣本重復(fù)三次實驗，250ng起始量的樣本重復(fù)一次實驗。5ng和50ng起始量的樣本結(jié)果標(biāo)注了標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示：針對不同質(zhì)量和起始量的樣本，使用NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒均能提高文庫產(chǎn)量。大多數(shù)雜交捕獲流程要求文庫產(chǎn)量大于200ng，即便起始量低至50ng時，使用NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒制備的FFPE DNA 文庫也可獲得足夠的文庫產(chǎn)量。


圖. NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒可以檢測到福爾馬林處理受損的參考標(biāo)準(zhǔn)DNA中的預(yù)期突變體。以50ng、100ng、250ng經(jīng)Covaris打斷的福爾馬林處理受損的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（嚴(yán)重）（Horizon Discovery HD803）為起始樣本，使用NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒或NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒制備文庫，重復(fù)三次。所有文庫均投入custom cancer panel（Twist Bioscience）進行靶向富集實驗流程，進行6重捕獲反應(yīng)。所有文庫均使用Illumina NovaSeq 6000（2×100 堿基）測序。所有fastq文件向下抽取2200萬個雙端Reads，使用BWA mem（version 0.7.17）將Reads比對至T2T參考基因組，并使用Picard MarkDuplicate（version 1.56.0）標(biāo)記重復(fù)。使用Samtools（version 1.16.1）從Mpileup計算變異等位基因頻率（VAF），并根據(jù)Horizon參考DNA中的預(yù)期VAF繪圖。頻率為0.88%的變體在50ng起始量樣本的1/3重復(fù)中缺失，但在100ng和250ng起始量的所有重復(fù)樣本中均檢測到所有變體。與標(biāo)準(zhǔn)文庫制備（NEBNext Ultra II DNA 文庫制備試劑盒）相比，NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒提高了低起始量（50ng）文庫預(yù)期的VAF的相關(guān)性，結(jié)果表明：NEBNext FFPE DNA 文庫制備試劑盒能顯著提高文庫產(chǎn)量和覆蓋度。

 

 

 


四、通用型DNA建庫試劑盒（Illumina+MGI用）

NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶（貨號E9620），是一款通用DNA文庫構(gòu)建試劑盒，可用于Illumina、MGI華大智造測序儀，并針對MGI測序儀進行深度優(yōu)化，以實現(xiàn)更高測序表現(xiàn)。NEBNext FS DNA 建庫試劑盒，整合了酶法片段化、末端修復(fù)、加dA尾步驟，通過同一種酶混合物調(diào)整片段大小。該建庫試劑盒樣本起始量范圍廣，使用0.1ng~500ng DNA 均可制備高質(zhì)量DNA文庫。該試劑盒+NEBNext多樣本接頭引物試劑盒E9640+NEBNext環(huán)化模塊E9635聯(lián)合使用，可用于MGI測序平臺。

·高產(chǎn)量文庫，滿足更多實驗需求；
·樣本起始量范圍廣，0.1ng~500ng起始量的完整DNA均可制備高質(zhì)量文庫；
·均一的轉(zhuǎn)錄本覆蓋度和GC覆蓋度；
·較低的重復(fù)率和嵌合體率；
·更大限度減少接頭二聚體；
·實驗便利，建議使用同一種接頭稀釋濃度；
·節(jié)省時間，精簡實驗流程，減少手動操作，與自動化兼容。


圖. NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶實驗流程。實驗流程精簡，盡可能減少手動操作時間，起始量范圍廣，適用于0.1ng~500ng起始量的樣本。


圖. 針對不同起始量樣本，NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能實現(xiàn)可靠的文庫制備，且不會產(chǎn)生接頭二聚體。以0.1ng~500ng人類gDNA（NA12878，Coriell Institute for Medical Research）為起始樣本，使用如圖所示的PCR循環(huán)數(shù)制備文庫。除0.1ng起始量外，對平均片段大小為250bp的DNA進行片段篩選，0.1ng起始量的樣本進行磁珠純化，以避免樣本過度損失并保持文庫的復(fù)雜性。除了0.1ng起始量樣本使用了10倍稀釋外，其它所有起始量樣本都使用了統(tǒng)一的未經(jīng)稀釋的接頭濃度。
A：所有起始量樣本文庫均未觀察到接頭二聚體的條帶（約150bp片段處）。
B：針對不同起始量的樣本，使用NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能提高文庫產(chǎn)量。每個柱形圖代表8~18次重復(fù)的平均產(chǎn)量，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。M=DNA Marker


圖. 針對不同起始量樣本，NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能制備出具有優(yōu)秀測序指標(biāo)的高質(zhì)量文庫。以0.1ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）為起始樣本，制備重復(fù)文庫，隨后在MGI G99 平臺上測序（PE100）。測序數(shù)據(jù)向下采樣350萬對雙端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）將Reads比對至 GRCh38參考基因組，并使用Picard MarkDuplicates（version 1.56.0）標(biāo)記重復(fù)。使用Picard Alignment Summary Metrics（version 1.56.0）評估文庫質(zhì)量。所有文庫都可實現(xiàn)高比對率、低嵌合體率和低接頭二聚體率。該實驗中1ng起始量樣本文庫的接頭二聚體略高（約1%），但可通過稀釋接頭來優(yōu)化。除了0.1ng起始量樣本使用了10倍稀釋外，其它所有起始量樣本都使用了統(tǒng)一的未經(jīng)稀釋的接頭濃度。


圖. 針對不同起始量樣本，NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能實現(xiàn)均一的GC覆蓋度。以0.1 ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）為起始樣本，制備重復(fù)文庫，隨后在MGI G99 平臺上測序（PE100）。測序數(shù)據(jù)向下采樣350萬對雙端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）將Reads比對至GRCh38參考基因組，并使用Picard MarkDuplicates（version 1.56.0）標(biāo)記重復(fù)。使用Picard's CollectGCBiasMetrics（1.56）計算GC覆蓋度，但該工具采用了偶數(shù)拷貝數(shù)假設(shè)，所以僅適用于人類常染色體。所有起始量都實現(xiàn)了均一的GC覆蓋度。在GC覆蓋度圖中，水平的灰色線表示預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)化覆蓋度為1.0，不同綠色陰影的點代表每個GC%處的reads數(shù)量。下方的灰色區(qū)域圖是直方圖，表示參考基因組中每100bp窗口的GC含量分布。


圖. 針對不同起始量樣本，NEBNext FS DNA 文庫制備試劑盒含片段化酶均能制備插入片段大小一致的高質(zhì)量文庫。以0.1ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）為起始樣本，制備重復(fù)文庫，對1ng~500ng 起始量的樣本進行250bp的片段篩選，或?qū)?.1ng起始量的樣本進行簡單的磁珠純化，從而保持文庫的復(fù)雜性。文庫混樣后在MGI G99 平臺上測序（2×100 base reads），測序數(shù)據(jù)向下采樣350萬對雙端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）將reads比對至GRCh38參考基因組，并使用Picard CollectInsertSizeMetrics（v1.56.0）計算插入片段大小分布情況。經(jīng)片段篩選后的所有起始量樣本文庫，都實現(xiàn)了一致的250bp的插入片段大小。相比之下，在0.1ng起始量的樣本文庫結(jié)果中，觀察到較小的片段大小分布，這是因為使用了基于磁珠的純化步驟來去除接頭二聚體和過量的接頭，而沒有進行片段篩選。

 

 

 

 
五、U型接頭/環(huán)形測序接頭

NEBNext采用的環(huán)形測序接頭/U型接頭，具有65nt的發(fā)夾環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可高效連接經(jīng)過末端修復(fù)并加dA尾的DNA片段，并大幅減少接頭二聚體的形成。接頭環(huán)狀結(jié)構(gòu)中包含一個U，經(jīng)NEB USER酶（UDG和核酸內(nèi)切酶Endo VIII 的混合物）處理去除U后，環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開成為PCR底物，再使用NEBNext Index 引物通過PCR引入P5/P7序列、樣本標(biāo)簽Index序列（Barcode），實現(xiàn)多重測序文庫制備。



NEBNext接頭引物試劑盒提供雙端Index引物、單端Index引物，試劑盒包含三大組分，即短的U型接頭、長的帶Index的PCR引物、USER酶，以用于Illumina、MGI平臺NGS文庫制備；同時還提供完整Y型接頭UMI接頭，用于不進行PCR的建庫流程。





 

 

 

 
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