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IDT NGS二代測序文庫均一化試劑盒
——獲得高度穩(wěn)定且均一化處理的DNA/RNA測序文庫

 
北京澤平代理的美國進(jìn)口IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒，采用了一種新型酶促文庫均一化處理技術(shù)，可對Illumina測序儀測序前的DNA或RNA文庫進(jìn)行均一化處理。通過IDT文庫均一化試劑盒，上機(jī)前無需進(jìn)行單個文庫濃度檢測，可得到優(yōu)化的簇密度和更均衡的文庫。IDT文庫均一化處理試劑盒可搭配常規(guī)建庫實(shí)驗(yàn)流程，不僅能縮短實(shí)驗(yàn)整體的操作時間，還能提高NGS文庫上機(jī)濃度的精確性，實(shí)現(xiàn)混合文庫間測序數(shù)據(jù)量的均一性。IDT文庫均一化處理實(shí)驗(yàn)流程包括文庫的非偏好性選擇、酶均一化反應(yīng)，在文庫擴(kuò)增中使用帶有Normalase標(biāo)記的引物，可穩(wěn)定得到3倍于目標(biāo)均一化濃度的產(chǎn)量。例如上機(jī)前文庫濃度需要均一化為2nM或4nM的標(biāo)準(zhǔn)文庫產(chǎn)量，則IDT均一化反應(yīng)前文庫濃度至少分別為6nM或12nM（20ul體積）。該實(shí)驗(yàn)過程中不需要增加額外PCR步驟，僅需將常規(guī)文庫擴(kuò)增引物替換成帶有Normalase標(biāo)記的測序通用引物或帶有樣本標(biāo)簽的引物。IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒為高通量實(shí)驗(yàn)室提供了快速、可擴(kuò)展的文庫標(biāo)準(zhǔn)化工作流程。


優(yōu)勢

①節(jié)省時間，提高通量：統(tǒng)一的樣本處理過程，生成平衡均一的混合文庫；

②減少文庫測序差異，降低測序費(fèi)用：得到更平衡的混合文庫，允許更多的樣本混合上機(jī)，降低測序成本；

③適用多種工作流程，設(shè)計(jì)靈活：兼容多種文庫制備方法，獲得均一平衡的測序數(shù)據(jù)。



圖. IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒的工作流程始于建庫接頭連接反應(yīng)后，工作流程根據(jù)使用全長或短接頭而不同。通過Normalase PCR，將文庫擴(kuò)增到均一化處理反應(yīng)所需最低數(shù)量，然后進(jìn)行下游的酶均一化處理。在此過程中，如連接反應(yīng)中使用全長接頭，PCR擴(kuò)增需使用帶有Nomalase標(biāo)記的測序通用引物；如使用非全長接頭，則需使用帶有Normalase標(biāo)記的樣本標(biāo)簽作為擴(kuò)增引物。將擴(kuò)增好的單個NGS文庫分別進(jìn)行15分鐘Normalase l 孵育，此反應(yīng)過程使用酶促法，可以無偏好性地選擇指定摩爾濃度的NGS文庫。之后，將每個文庫等體積的混合到一管中，進(jìn)行15分鐘Normalase II 孵育，酶促法將每個NGS文庫標(biāo)準(zhǔn)化到指定的摩爾濃度。實(shí)現(xiàn)上機(jī)測序前，得到平衡且均一化的NGS混合文庫。

 

 
一、不同片段大小，也可得到高度穩(wěn)定且均一化測序文庫



表. 使用IDT Normalase試劑盒將文庫均一化處理成4nM，上樣濃度為12pM，得到和預(yù)期一致的簇密度（Illumina MiSeq測序，v2版本試劑）。
 
 

 
二、相比傳統(tǒng)上機(jī)定量方式，可得到數(shù)據(jù)量更均一的混合文庫



圖．測試分別來自于兩名實(shí)驗(yàn)者（n=16/每名實(shí)驗(yàn)者）的32個樣品，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 試劑盒構(gòu)建文庫。實(shí)驗(yàn)樣本為NA12878 gDNA，起始量為1~250ng。Normalase PCR后的文庫使用qPCR方法定量，保證文庫達(dá)到Normalase反應(yīng)所需最低閾值。"qPCR"：基于qPCR定量結(jié)果，對文庫進(jìn)行均一化處理、混樣和測序；“Normalase"：同樣樣品使用Normalase試劑盒，對文庫進(jìn)行混樣、均一化處理和測序。比較兩種方法每種接頭測序產(chǎn)生數(shù)據(jù)百分比（Illumina MiSeq v2的50循環(huán)測序試劑盒）。結(jié)果顯示： qPCR混合文庫中文庫測序數(shù)量變異系數(shù)（CV）為22.5%，而Normalase混合文庫池的變異系數(shù)為9.4%（中位線為95%的置信區(qū)間）。




圖. 10ng NA12878 gDNA，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 試劑盒構(gòu)建96個文庫，搭配IDT xGen CDI接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增。文庫混樣、均一化處理前，使用Qubit定量結(jié)果做等體積的文庫混樣，之后使用Illumina MiSeq V2測序試劑盒上機(jī)測序（50個循環(huán)），通過每種接頭產(chǎn)生測序數(shù)據(jù)量百分比進(jìn)行比較。均一化反應(yīng)之前混合文庫池CV為15.5%，證明Normalase引物的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。將相同的文庫均一化處理到4nM，并使用Illumina MiSeq V2 50循環(huán)測序試劑盒上機(jī)測序。均一化處理后，文庫CV降為7.7%，證明通過IDT xGen Normalase 可得到更加均一化的混合文庫（中位線為95%置信區(qū)間）。

 


圖. 針對不同GC%含量基因組細(xì)菌的測序覆蓋度及冗余率結(jié)果

使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 建庫試劑盒，起始量為100ng DNA，包含三種不同比例混合的參考菌株（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈酶球菌）。片段化DNA至350bp，建庫時搭配全長的Y型接頭進(jìn)行連接，使用Normalase標(biāo)記的通用測序引物擴(kuò)增3、5或7個循環(huán)。依據(jù)qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫混合，并使用Illumina MiSeq PE150 測序。測序結(jié)果顯示，不同GC%含量基因組細(xì)菌的測序覆蓋度及冗余率沒有顯著差異。




圖. 使用IDT文庫均一化試劑盒，對插入片段大小即菌種覆蓋度評估無影響

將5ng的MSA-1000樣品（GC%基因組含量不同的10種等比例混合菌株），用IDT xGen DNA Library Prep EZ 試劑盒構(gòu)建文庫，分別用IDT Normalase標(biāo)記引物（紫紅色）和IDT普通引物（藍(lán)色）對兩個文庫進(jìn)行擴(kuò)增。使用IDT均一化試劑盒或Qubit將文庫均一化處理為4nM。進(jìn)行Illumina MiniSeq 平臺高通量上機(jī)（PE-150）測序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的基因組文庫中（由不同GC%含量的細(xì)菌組成），經(jīng)IDT均一化處理的文庫，仍保持著穩(wěn)定插入片段大小（A）和高基因組覆蓋度（B）。

 

 
三、文庫均一化試劑盒的使用，不影響原有RNA測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

平行對比RNA文庫進(jìn)行上機(jī)前均一化處理使用IDT文庫均一化試劑盒（n=2）、qPCR方法（n=2）的效果。4個RNA-seq文庫（50ng人腦mRNA樣本）分別使用帶有Normalase標(biāo)記的雙端樣本標(biāo)簽、常規(guī)雙端樣本標(biāo)簽進(jìn)行文庫制備。將帶有常規(guī)樣本標(biāo)簽的文庫（標(biāo)記為"1"和"2"號文庫），按qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫均一化及混樣。將帶有Normalase標(biāo)記的文庫（標(biāo)記為"3"和“4號文庫），在文庫制備完成后，搭配IDT文庫均一化試劑盒，將RNA文庫均一化處理至4nM。通過MiniSeq （2×150）上機(jī)測序，證明IDT文庫均一化試劑盒對RNA-seq分析結(jié)果無影響。將各文庫均一化處理至4nM后上機(jī)測序，使用STAR、Picard及RSeQC進(jìn)行比對、進(jìn)行RNA-sec數(shù)據(jù)分析。韋恩圖結(jié)果顯示，每個樣本中檢測到的前1000個轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒有顯著差異。


 

表. 相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進(jìn)行文庫均一化處理，其RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫均一化處理，因而兩種文庫均一化處理有著近似的RNA-seq分析結(jié)果，與預(yù)期相符。
 



表. 相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進(jìn)行文庫均一化處理，其1000個高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫均一化處理，因而二者的1000個高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本RNA-seq分析結(jié)果近似，與預(yù)期相符。

 
圖. 韋恩圖顯示每個樣本中檢測到的前1000個轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒有顯著差異
 


 

 
IDT文庫均一化試劑盒優(yōu)勢

①可靈活調(diào)整均一化處理后文庫濃度，只需樣本擴(kuò)增后濃度超過最少文庫量閾值，即可保證最終所需文庫濃度均一化；

②處理后的均一化文庫濃度為4nM，選擇使用≥6nM均一化工作流程時，最終文庫濃度為2nM；

③混合文庫間測序變異系數(shù)系數(shù)≤10%；

④試劑盒兼容性強(qiáng)，可兼容全長測序接頭或短接頭的建庫流程；兼容非靶向富集的工作流程，制備的文庫可直接測序（如全基因組測序或全轉(zhuǎn)錄組測序）；兼容雜交捕獲流程，即靶向富集完成后上機(jī)前的文庫均一化。需保證均一化反應(yīng)前，有穩(wěn)定的文庫產(chǎn)量（20μL反應(yīng)體系中文庫摩爾濃度≥6nM或≥12nM），以得到標(biāo)準(zhǔn)的2nM/4nM文庫量；

⑤兼容IDT xGen接頭、IDT xGen Normalase CDl引物、IDT xGen Normalase UDI引物；

⑥兼容Illumina測序平臺，并可獲得一致的測序結(jié)果。
 

 

北京澤平代理的IDT文庫均一化試劑盒產(chǎn)品
 

 


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——IDT一級代理商，北京澤平